Menyingkap Biomarker Utama Dan Mekanisme Dalam Kardiomiopati Septik Sebuah Kajian

---

Pengenalan Sepsis teruk merupakan salah satu penyebab utama kematian di unit rawatan rapi dan telah menjadi punca besar kematian di negara maju dan membangun. Septik kardiomiopati (SCM), kegagalan fungsi jantung akut akibat sepsis, adalah keadaan yang boleh dirawat jika dikenalpasti lebih awal. Meskipun banyak kajian dijalankan untuk memahami mekanisme molekul SCM, pengenalan tepat mengenai karakteristik dan petunjuk prognostik masih sukar diperolehi. Oleh itu, mengenalpasti gen-gen asas dan biomarker yang berkesan dalam SCM sangat penting untuk diagnosis awal, pencegahan, dan intervensi. Mengingat SCM adalah sindrom patofisiologi yang disebabkan oleh jangkitan, mengenal pasti jangkitan yang menjadi sasaran adalah penting untuk mengurangkan kematian dan morbiditi. Kajian sebelum ini menemukan bahwa bahan seperti lipopolisakarida, prostanoid, sitokin, sistem komplemen, dan nitric oxide mungkin terlibat dalam peningkatan fungsi jantung yang terganggu.
Dari kemunculan teknologi bioinformatik, kajian mengenai fungsi dan mekanisme pengawalan gen telah menjadi pendekatan utama dalam merawat penyakit. Gene Expression Omnibus (GEO) adalah pangkalan data terbuka yang mengandungi banyak profil ekspresi gen untuk berbagai penyakit. Pangkalan data ini berfungsi sebagai sumber yang berharga bagi analisis ekspresi gen, analisis fungsional, dan mengenal pasti gen yang diekspresikan dengan berbeza (DEGs) terkait SCM. Walaupun kajian yang lalu telah mengenal pasti banyak biomarker untuk SCM, tetapi kajian-kajian tersebut tidak melakukan pengesahan eksperimen dan hanya menggunakan analisis bioinformatik, tanpa menjelajahi hubungan antara SCM dengan imuniti atau kematian sel terprogram. Dalam kajian ini, kami mengenal pasti gen-gen pusat dan faktor transkripsi serta menyelidiki hubungan antara SCM dan pelbagai proses biologi termasuk imuniti, ferroptosis, pyroptosis, cuproptosis, dan metilasi RNA m6A, memberikan platform untuk penyelidikan masa depan tentang mekanisme yang berpotensi.
Bahan dan Kaedah Pengumpulan dan Pemprosesan Data Kami menggunakan pangkalan data GEO (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds) untuk pengumpulan data. Dataset GSE53007 terpilih sebagai objek kajian kami. Gen-gen yang diekspresikan berbeza (DEGs) ditentukan oleh nilai p dan perubahan lipatan (FC) dengan ambang nilai P yang disesuaikan (fdr) < 0.05 dan |log2 FC| ≥1. Semua data dimuat turun secara dalam talian dan terbuka.
Analisis Peningkatan Fungsional Kami menggunakan pakej R “clusterProfiler” untuk menjalankan analisis pengayaan laluan Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) dan kategori fungsi gen (GO). Analisis pengayaan yang berdasarkan DEGs membantu kami mengenali patogenesis SCM dan kami juga menggunakan plot gelembung untuk memvisualisasikan hasil tersebut.
Jaringan Interaksi Protein–Protein (PPI) Untuk menyelidiki hubungan antara gen-gen ini, kami menganalisis dan memvisualisasikan jaringan PPI melalui laman web STRING (https://string-db.org/) berdasarkan DEGs SCM. Pangkalan data STRING digunakan untuk meramalkan jaringan PPI DEGs dan menganalisis interaksi antara protein.
Model Pembelajaran Random Forest (RF) dan Extreme Gradient Boosting (XGBoost) serta Pengenalan Gen Pusat Metode pembelajaran Random Forest (RF) mengintegrasikan hasil dari pelbagai pokok keputusan yang dihasilkan melalui pengambilan sampel bootstrap dari dataset latihan dan secara rawak memilih subset pembolehubah dari keseluruhan set sifat di setiap pokok. Kajian ini melaksanakan metode RF berdasarkan kajian sebelumnya. Teknik Extreme Gradient Boosting (XGBoost) mengandalkan algoritma yang peka terhadap kepadatan dan pensketchan kuantitatif yang diberat, di mana pembelajar lemah disatukan secara berurutan untuk menghasilkan pemelajaran yang kuat.
Pengenalan Faktor Transkripsi Pangkalan data TRRUST (https://www.grnpedia.org/trrust/) adalah sumber berharga untuk meramalkan jaringan pengawalan transkripsi dalam manusia dan tikus. Setelah gen-gen yang telah disahkan disaring ke dalam TRRUST, kami menyemak interaksi antara gen-gen dan faktor transkripsi, membina jaringan, dan memaparkannya menggunakan Cytoscape.
Analisis dan Sequencing Sel Tunggal Dari pangkalan data GEO, kami memilih GSE207363 sebagai fokus kajian. Metodologi yang diterangkan dalam artikel diterbitkan diikuti untuk melaksanakan pakej Seurat. Kami menggunakan fungsi Anchors dari pakej R Seurat untuk mengintegrasikan paket data sepsis. Pertama, pakej Seurat digunakan untuk kawalan kualiti dan standardisasi. Kemudian, Analisis Komponen Utama (PCA) dijalankan bagi mengatasi masalah yang timbul dari dimensi tinggi matriks ekspresi. Teknik pengurangan dimensi dan visualisasi Yang dikenali sebagai Approximation Manifold Unit dan Projection (UMAP) juga digunakan dalam kajian ini. Gen penanda tertentu untuk setiap subtipe sel dikenalpasti dengan memilih yang mempunyai log2FC purata lebih dari 1 dan p_val_adj kurang dari 0.05. Penandaan manual bagi kelompok sel dilakukan untuk membezakan antara pelbagai jenis sel dari pangkalan data PanglaoDB. Kami menggunakan set penanda gen yang jelas untuk mengklasifikasi pelbagai jenis sel. Misalnya, penanda gen Adgre1, Fcgr1 dan Cd68 digunakan untuk klasifikasi makrofag, manakala Pecam1, Vwf dan Emcn digunakan untuk sel endothelial, dan seterusnya.
Pengeluaran Model Kecederaan Myokardium Induced Sepsis dalam Tikus Kajian ini diluluskan oleh Jawatankuasa Etika Haiwan Hospital Umum Shanghai. Sebanyak 20 tikus jantan C57/BL6 berumur 8 minggu dihimpunkan dari Pusat Haiwan Makmal di Hospital Umum Shanghai. Semua tikus disimpan dalam persekitaran makmal bebas patogen di bawah suhu terkawal dan kelembapan tertentu. Tikus dibahagikan kepada dua kumpulan: kumpulan kawalan dan kumpulan yang dirawat dengan lipopolisakarida (LPS). Tikus dalam kumpulan LPS diinjeksikan secara intraperitoneal dengan LPS, manakala tikus dalam kumpulan kawalan menerima injeksi dengan larutan normal. Tikus dibunuh 36 jam selepas rawatan LPS dan jantung mereka diambil untuk kajian lanjut.
Pengukuran Ekokardiografi Kami melakukan ekokardiografi transthoracic dengan menggunakan VEVO 3000. Tikus dibius dengan isoflurane, dicukur dengan krim depilasi, dan diletakkan di atas plat pemanasan dalam posisi terlentang. Sepanjang prosedur, kadar jantung dan suhu dipantau. Pandangan dua dimensi garis panjang parasternal diperoleh untuk pengukuran B-mode dan M-mode. Kontur endokardium ditarik dari pandangan garis panjang akhir diastolik dan systolik; vol diastolik akhir dan systolik LV diukur, dan kadar ejeksi (EF) dikira.
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) Konsentrasi IL-1β, IL-6 dan cTnI dalam plasma tikus dikesan menggunakan ELISA dengan kit komersial. Antibodi terhadap IL-1β, IL-6, dan cTnI diinkubasi dengan sampel selama 2 jam sebelum menambah antibodi konjugat dan HRP-conjugated anti-mouse imunoglobulin secara berasingan.
Pewarnaan Haematoksilin dan Eosin (HE) Setelah merendam jantung dalam paraformaldehid 4%, ia dihapuskan dan disemat dalam parafin. Bahagian tisu tersebut diletakkan dalam xylene dan kemudian dalam etanol untuk pengeluaran cairan. Pewarnaan HE dilakukan mengikut arahan ketua kit. Gambar-gambar diambil setelah proses pencelupan selesai.
Ujian Immunohistokimia (IHC) Pemotongan hati terlebih dahulu dirawat dengan paraformaldehid untuk pengawetan, dihulurkan dan disematkan dalam parafin. Bahagian tisu tersebut kemudian menjalani proses dekankerasi dan penghidratan sebelum diinkubasikan dengan antibodi.
Pengekstrakan RNA dan PCR Kuantitatif Secara Masa Nyata Kami menggiling jantung beku untuk ekstraksi RNA menggunakan reagen RNAiso Plus. RNA yang diekstrak kemudian diubah menjadi cDNA dengan menggunakan PrimeScript RT Master Mix. Pengujian qPCR dilakukan dengan menggunakan sistem reaksi PCR masa nyata Quantstudio. Ekspresi 10 gen yang diekspresikan berbeza dan 6 gen faktor transkripsi dinormalisasi terhadap tahap ekspresi GAPDH.
Western Blotting Western blotting dijalankan dengan melisiskan sampel dalam pengencer RIPA, memisahkan lysate melalui SDS–PAGE, dan mentransfer protein ke membran PVDF. Membran diblok selama 2 jam sebelum diinkubasi dengan antibodi primer dan seterusnya antibodi sekunder yang sesuai.
Analisis Hubungan Antara SCM dan Pencerobohan Sel Imun, Mikros lingkungan Imun, Molekul Pemeriksaan Imun, Ferroptosis, Pyroptosis, Cuproptosis, dan Metilasi RNA m6A Dari segi imuniti, tiga aspek telah dianalisis termasuk pencerobohan sel imun, mikros lingkungan imun, dan molekul pemeriksaan imun. Kami menggunakan alat analisis CIBERSORT untuk menentukan tahap pencerobohan sel imun. Kami juga menjalankan analisis menggunakan algoritma ESTIMATE untuk menilai mikros lingkungan imun termasuk skor bertalian dan skor estimasinya.
Analisis Statistik Data dan figura dalam kertas ini dianalisis menggunakan perisian SPSS dan GraphPad Prism. Semua nilai p-nilai dianggap signifikan apabila p < 0.05.
Keputusan Proses Pengolahan Data dan Pengenalpastian DEGs dalam SCM Dalam kajian ini, kami memilih dataset GSE53007 dari pangkalan data GEO untuk analisis lanjut. Dataset ini terdiri dari empat sampel tisu jantung tikus normal dan empat sampel tisu jantung SCM. Berdasarkan ambang nilai P yang disesuaikan dan |log2 FC|, kami mengenal pasti sebanyak 374 DEGs dalam SCM, termasuk 268 gen yang meningkat dan 106 gen yang menurun. Kami juga memilih 100 gen yang diekspresikan secara berbeza untuk dianalisis lebih lanjut.

Gambar 1 Carta aliran kajian.
Gambar 2 Pemrosesan data dan pengenalan DEGs serta jaringan PPI berdasarkan DEGs dan analisis pengayaan fungsi dalam SCM; (A) Plot gunung berapi DEGs. (B) Peta haba DEGs.
Jaringan PPI Berdasarkan DEGs dan Analisis Pengayaan fungsi dalam SCM Jaringan PPI menganalisis hubungan antara gen-gen ini berdasarkan DEGs SCM. Berdasarkan tahap keterhubungan tertinggi, 30 gen terpilih sebagai biomarker utama dalam SCM. Analisis pengayaan GO menunjukkan DEGs dikelompokkan dalam proses biologi, komponen sel, dan fungsi molekul. Pada kumpulan proses biologi, DEGs kaya dalam pengaturan sitokin, tindak balas kepada lipopolisakarida, dan lain-lain.
Pengenalan Gen Pusat melalui Model RF dan XGB Untuk membangunkan tandatangan gen diagnostik untuk SCM, model RF dan XGB dibina secara berasingan. Model RF gayanya lebih baik, dengan 10 gen dikenali dan dipaparkan dalam harapan pemetaan hubungan.
Gambar 3 Pembinaan model RF dan XGBoost serta pengenalan gen pusat.
Pengasasan Murine SCM Model Kami menggunakan pewarnaan HE untuk mengkaji perubahan patologi jantung antara kumpulan kawalan dan kumpulan LPS. Hasil pewarnaan HE menunjukkan tiada perubahan histopatologi pada tisu jantung tikus dalam kumpulan kawalan, sementara kumpulan model menunjukkan kerosakan ketara pada tisu jantung dengan edema dan nekrosis sel. Kami juga menilai ekspresi IL-1β dan IL-6 melalui analisis immunohistokimia dan mendapati peningkatan ketara.
Gambar 4 Pengasasan model murine SCM yang berjaya.
Pengesahan PCR Kuantitatif untuk Biomarker Pusat SCM Ekspresi 10 gen teratas dalam dataset GSE53007 dibentangkan, 9 dari 10 gen menunjukkan pola ekspresi yang berbeza antara kumpulan SCM dan kawalan.
Gambar 5 Validasi qPCR biomarker pusat untuk SCM.
Data Sequencing mRNA Sel Tunggal Kami menganalisis data sequencing sel tunggal dan mendapati 10 jenis sel utama, termasuk makrofag dan sel endotel. Penemuan kami menunjukkan bahawa kecederaan miokardium yang disebabkan sepsis mengakibatkan peningkatan populasi sel neutrofil dan makrofag.
Gambar 6 Analisis kluster dan pengayaan data UMAP.
Gambar 7 Pembahagian ekspresi gen pusat dalam pelbagai jenis sel.
Pengenalan Faktor Transkripsi (TF) Kajian seterusnya pula memasukkan analisis jaringan interaksi antara faktor transkripsi dengan gen pusat. Enam faktor transkripsi diidentifikasi, di mana Irf1 dan Stat1 adalah pengatur utama ekspresi gen dalam SCM, memberi gambaran lebih mendalam mengenai interaksi molekul gen ini.
Gambar 8 Pengenalan faktor transkripsi.
Hubungan Antara SCM dengan Pencerobohan Sel Imun, Mikros lingkungan Imun, dan Molekul Pemeriksaan Imun Kami mengkaji hubungan antara SCM dan tahap infiltrasi sel imun. Kami menggunakan alat CIBERSORT untuk menganalisis hasil sasaran, dan mendapati hubungan signifikan antara SCM dan beberapa jenis pencerobohan sel imun, terutamanya melibatkan makrofag M1.
Gambar 9 Analisis pencerobohan sel imun.
Hubungan SCM dengan Ferroptosis, Pyroptosis, Cuproptosis, dan Metilasi RNA m6A Kami menyelidiki hubungan SCM dengan pelbagai bentuk kematian sel, dan mendapati peranan signifikan ferroptosis dan pyroptosis dalam SCM. Kami mengamati ekspresi gen yang berbeza antara kumpulan kontrol dan SCM untuk membuktikan ini.
Gambar 10 Hubungan SCM dengan ferroptosis, pyroptosis, cuproptosis, dan m6A RNA metilasi.
Diskusi SCM adalah kondisi serius yang melibatkan disfungsi jantung akibat sepsis. Dalam kajian ini, kami menemui hubungan signifikan antara SCM dan gen-gen pusat termasuk Cd40 dan Tlr2. Gen-gen ini berperanan penting dalam respons keradangan dan pengawalan imun, yang sangat penting dalam patofisiologi SCM.
Kajian juga menemukan bahawa pengawalan aktif gen juga melibatkan faktor transkripsi seperti Stat1 dan Irf1, mungkin berfungsi sebagai pengatur utama dalam kemajuan SCM. Imuniti kardial juga berperan dalam perkembangan kardiomiopati bersepsis, memerlukan lebih banyak penyelidikan untuk mengaitkan penemuan ini dengan rawatan klinikal yang lebih baik.
Pihak kami berharap penemuan ini akan membuka jalan bagi strategi terapi baru dalam pengurusan SCM, memberikan pandangan berharga untuk pemahaman yang lebih baik mengenai mekanisme dibaliknya.
Had Walaupun kami sudah mengenal pasti ekspresi gen-gen pusat, penyelidikan lebih lanjut diperlukan untuk mengesahkan interaksi antara gen-gen ini.
Kesimpulan Kami menemui sembilan gen sebagai biomarker pusat dalam model SCM, serta dua pengatur transkripsi (Irf1 dan Stat1) yang mungkin mempengaruhi ekspresi gen lain. Penemuan ini berpotensi untuk menjadi sasaran dalam kajian masa depan dan membuka jalan bagi pendekatan terapi baru dalam pengurusan SCM.
Pernyataan Perkongsian Data Data pengurutan gen dimuat turun dari dataset Gene Expression Omnibus (GEO) (GSE53007 dan GSE207363; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/).
Kebenaran Etika dan Persetujuan untuk Mengambil Bahagian Kajian ini dilaksanakan dengan kelulusan Jawatankuasa Etika Haiwan, Hospital Umum Shanghai (IACUC:2023AW011). Kesejahteraan haiwan makmal mengikuti garis panduan untuk ulasan etika kesejahteraan haiwan mengikut standard nasional China.
Sumbangan Penulis Semua penulis menyumbang secara signifikan kepada kerja ini dalam reka bentuk, pelaksanaan, analisis, dan penerangan. Mereka turut terlibat dalam draf, semakan kritikal, dan memberikan persetujuan akhir untuk versi yang diterbitkan.
Pembiayaan Artikel ini dibiayai oleh Yayasan Sains Alam Semula Jadi China (No.82070335 kepada J. Hong) dan Yayasan Hospital Afiliat Universiti Perubatan Xuzhou (Grant No. 2020KC003 kepada D.D. Zhao).
Pendedahan Para penulis tidak mengisytiharkan sebarang kepentingan bersaing dalam kerja ini.
Rujukan 1. Reinhart K, dkk. Mengenali sepsis sebagai keutamaan kesehatan global – Resolusi WHO. N Engl J Med. 2017.
2. Lu NF, dkk. Tahap histone H4 plasma yang tinggi sebagai faktor risiko penting dalam perkembangan kardiomiopati sepsis. Balkan Med J. 2020.
3. Lin H, dkk. Status terkini kardiomiopati sepsis: sains asas dan kemajuan klinikal. Front Pharmacol. 2020.



Source link
The post Menyingkap Biomarker Utama dan Mekanisme dalam Kardiomiopati Septik: Sebuah Kajian appeared first on Edisi Viral Plus.

---