Virus Like Particles Yang Direkayasa Untuk Penghantaran Gen Lebih Efisien

---

Kajian: Evolusi terarah partikel virus yang direkayasa dengan peningkatan kecekapan pengeluaran dan transduksi. Kredit Imej: Dragon Claws / Shutterstock.com
Satu kajian baru yang diterbitkan dalam jurnal Nature Biotechnology membincangkan pembangunan sistem baru untuk evolusi terarah partikel virus seperti (eVLP) yang direkayasa, dengan keupayaan transduksi dan pengeluaran yang lebih baik.
Apakah eVLP? Keupayaan untuk menghantar makromolekul ke dalam sel dengan berkesan dan selamat in vitro dan in vivo adalah penting untuk pelbagai rawatan baru. Walaupun vektor virus yang berkaitan dengan adeno (AAV) boleh menghantar agen penyuntingan gen in vivo, ia mempunyai beberapa kekurangan.
Oleh itu, cara penghantaran tambahan diperlukan untuk mengatasi batasan ini. VLP adalah rangka virus yang mengemas dan menghantar muatan seperti ribonukleik asid (mRNA), protein, atau ribonukleoprotein (RNP). VLP menawarkan transduksi yang berkesan, tropisme tisu yang baik, pengeditan sasaran yang dikurangkan, dan ekspresi muatan yang sementara.
Dalam kajian ini, penulis mengembangkan eVLP yang membolehkan penghantaran gen dan protein dengan cekap in vitro dan in vivo. Dalam sistem ini, protein muatan disambungkan kepada protein Gag retrovirus dalam eVLP, yang mengarahkan penyimpanan muatan ke dalam partikel virus semasa ia terbentuk. Penyambung muatan-Gag mengandungi urutan pemisahan oleh protease retrovirus selepas pembentukan partikel, yang seterusnya melepaskan muatan di dalam partikel dan ke dalam sel yang ditransduksi.
Penemuan kajian Penyelidik telah membangunkan sistem evolusi terarah untuk eVLP. Pada permulaan, identiti varian eVLP dikaji menggunakan RNA panduan tunggal (sgRNA) yang berkod barcode untuk membolehkan pemilihan varian yang dikehendaki dengan sifat tertentu. Keserasian sgRNA yang berkod barcode dengan pengeluaran eVLP yang berfungsi telah dibangunkan, seterusnya memasukkan urutan barcode 15-pasangan ke dalam tetraloop sgRNA.
eVLP pengedit generasi keempat (v4) yang mengandungi muatan RNP ABE aktif digunakan untuk eksperimen pengesahan. eVLP standard v4 dihasilkan dengan memindahkan empat plasmid ke dalam sel penghasil, yang menyandikan gabungan Gag-ABE, poliprotein Gag-Pro-Pol MMLV, protein pembungkus virus vesikular G, dan sgRNA yang mengarah kepada pengeditan asas yang tepat.
Seterusnya, v4 eVLP yang mengandungi sgRNAs tetraloop atau berbarcode canonikal dengan empat barcode dipilih secara rawak diuji dengan mengukur kecekapan pengeditan asas mereka. Dikenal pasti bahawa eVLP berbarcode mempunyai potensi setara dengan eVLP standard, sementara eVLP dengan sgRNA berbarcode berbeza mempamerkan potensi yang sama. Tambahan pula, eVLP tanpa gabungan Gag-ABE mengemas 216 kali lebih sedikit sgRNA berbanding dengan v4 eVLP berkanonikal.
Eksperimen lanjut menunjukkan bahawa sgRNA berbarcode dapat digunakan untuk menandakan varian eVLP yang berbeza dan bahawa barcode yang kaya selepas pemilihan mengenal pasti varian dengan kecergasan yang lebih baik.
Sistem evolusi ini kemudiannya digunakan untuk mengubahsuai dan memilih kapsid dengan ciri yang lebih baik. Sehubungan itu, sebuah perpustakaan kapsid eVLP berbarcode yang mengandungi 3,762 mutan tunggal-residu daripada protein kapsid Gag MMLV dan domain nukleokapsid dalam muatan Gag-ABE telah dihasilkan.
Perpustakaan berbarcode ini digunakan untuk membina perpustakaan sel penghasil eVLP berbarcode. Transduksi lentiviral sel penghasil, diikuti dengan pengembangan sel yang ditransduksi, memperkuat fraksi sel penghasil dengan pasangan varian kapsid-barcode tunggal.
Perpustakaan kapsid eVLP berbarcode menjalani dua pemilihan untuk pengeluaran yang lebih baik dari sel penghasil dan transduksi sel HEK293T. Sebagai langkah, pengeluaran eVLP bermula dari perpustakaan sel penghasil berbarcode, dengan perpustakaan varian kapsid hasil yang disucikan.
Setelah itu, sgRNA yang dimuat dalam eVLP diasingkan, dan barcode yang ada selepas pemilihan pengeluaran disusun semula. Pengayaan pengeluaran eVLP dianggarkan untuk setiap urutan barcode, yang mengenal pasti barcode dengan pengayaan peningkatan berbanding yang berasal dari kapsid eVLP berkanonikal. Kira-kira 8% daripada mutan kapsid dalam perpustakaan menunjukkan pengayaan pengeluaran yang lebih baik berbanding kapsid eVLP berkanon.
Sel HEK293T dicampurkan dengan perpustakaan kapsid eVLP berbarcode yang disucikan. Selepas enam jam, sgRNA yang ditransduksi ke dalam sel sasaran diasingkan, dan pengayaan transduksi eVLP dikira untuk setiap urutan barcode.
Hanya 0.7% daripada semua mutan kapsid menunjukkan purata pengayaan transduksi yang lebih tinggi berbanding kapsid v4 eVLP berkanon. Walaupun kebanyakan mutan kapsid mempunyai kecekapan transduksi dan pengeluaran yang lebih buruk daripada kapsid v4 berkanon, tiada mutan yang menunjukkan peningkatan dalam pengeluaran atau transduksi, menunjukkan mekanisme yang berbeza mungkin mempengaruhi kecekapan ini.
Beberapa mutan terpilih untuk analisis lanjut berdasarkan pengayaan pemilihan pengeluaran atau transduksi yang positif. Mutan yang meningkatkan satu sifat tanpa menjejaskan yang lain diprioritaskan.
Memperkenalkan mutasi kapsid ke dalam konstruksi Gag-ABE tidak meningkatkan potensi. Ini mendorong penyelidik untuk menilai potensi mutan kapsid dalam konstruksi Gag-ABE dengan mutasi Q226P, yang paling banyak diperkaya dalam pemilihan pengeluaran dalam konstruksi Gag-Pro-Pol (GagQ226P-Pro-Pol).
Pelbagai mutan kapsid meningkatkan potensi penghantaran BE hingga tiga kali ganda berbanding v4 eVLPs. Lima mutasi, termasuk C507V, C507F, A505W, D502Q, dan R501I, menunjukkan potensi tertinggi; namun, satu kombinasi mutan, GagC507V-ABE dengan GagQ226P-Pro-Pol, menunjukkan 3.7 kali peningkatan potensi dan dinamakan sebagai generasi kelima (v5) BE-eVLP.
Potensi v4 dan v5 BE-eVLP dibandingkan, yang menunjukkan v5 BE-eVLP mempunyai kecekapan pengeditan asas yang lebih tinggi dan lebih kuat berbanding v4 BE-eVLP. Menariknya, kecekapan pengeditan maksimum yang dicapai dengan v4 BE-eVLP diperoleh daripada dos v5 BE-eVLP yang 16 kali lebih rendah.
Kesimpulan Penyelidik dalam kajian ini telah membangunkan sistem evolusi terarah untuk eVLP dengan sifat yang dikehendaki dan menggunakan sistem ini untuk mengubah suai/memilih mutan kapsid eVLP dengan ciri yang lebih baik. Tambahan lagi, v5 eVLP dengan peningkatan dalam pemuatan dan pelepasan, saiz partikel yang lebih besar, dan potensi penghantaran yang lebih tinggi daripada v4 eVLP dibangunkan. Secara keseluruhannya, kaedah evolusi eVLP berbarcode ini dapat menyokong pembangunan kenderaan penghantaran masa depan yang dapat mengatasi batasan sistem penyuntingan gen yang ada.
Rujukan jurnal:
Raguram, A., An, M., Chen, P. Z., & Liu, D. R. (2024). Directed evolution of engineered virus-like particles with improved production and transduction efficiencies. Nature Biotechnology. doi:10.1038/s41587-024-02467-x

Source link
The post Virus-Like Particles yang Direkayasa untuk Penghantaran Gen Lebih Efisien appeared first on Edisi Viral Plus.

---