Epidemiologi Genomik C Difficile St81 Rt369 Di Malaysia

---

Pengenalan Clostridioides difficile adalah patogen yang penting bagi cirit-birit yang berkaitan dengan penggunaan antibiotik serta cirit-birit di hospital. CDC di AS telah mengklasifikasikan penyakit ini sebagai “ancaman mendesak” (https://www.cdc.gov/).1 Hasil klinikal bagi jangkitan C. difficile (CDI) boleh berbeza-beza, dari cirit-birit yang sembuh sendiri hingga kepada kolitis pseudomembran dan megakolon toksik yang mengancam nyawa.2 Dua toksin utama yang terlibat dalam CDI adalah toksin A (TcdA, enterotoksin) dan toksin B (TcdB, sitotoksin).3 Selain itu, toksin ketiga, toksin binari (CDT), juga telah dikaitkan dengan peningkatan keparahan jangkitan manusia, seperti dalam strain hypervirulen C. difficile NAP1/BI/027.4 Namun, penting untuk diingat bahawa tidak semua strain C. difficile yang menghasilkan toksin menghasilkan toksin yang disebutkan tadi.
C. difficile jenis urutan (ST) 37, yang negatif TcdA tetapi positif TcdB, menjadi salah satu ST yang paling umum dan dianggap penyebab utama CDI serta wabak global.5 Di Asia, ST81 (juga negatif TcdA dan positif TcdB) muncul sebagai genotip biasa yang berkaitan dengan ribotip (RT) 369.6,7 Pada awal kajian epidemiologi molekul, ST81 hanya terdapat dalam prevalensi yang rendah dan merupakan strain endemik.8 Namun, kajian terkini menunjukkan bahawa ST81 secara perlahan menggantikan ST35, ST3, dan ST37, dan kini menjadi strain yang dominan di beberapa kawasan di daratan China.6,9 Sebagai contoh, ST81 menyumbang 26.4% daripada semua C. difficile toksigenik yang diasingkan di empat hospital terkemuka di Beijing, China.6 Tambahan pula, dengan menggunakan penjujukan genoma penuh (WGS), strain ST81 dilaporkan telah menyebabkan wabak di sebuah hospital terkemuka di Shanghai.10 Menariknya, kajian oleh Liu et al. mendapati bahawa pesakit yang dijangkiti ST81 lebih mungkin mempunyai kadar kel存survivan yang rendah berbanding mereka yang dijangkiti dengan strain bukan ST81.11 Untuk memahami ciri epidemiologi ST81, beberapa kajian genomik telah dilakukan. Satu kajian analisis genom menunjukkan bahawa ST81 mempunyai mutasi asid amino berfrekuensi tinggi dalam gyrA (Thr82Ile), yang memberikan rintangan terhadap fluoroquinolone.6 Berbanding dengan ST37, isolat ST81 menunjukkan kemampuan yang lebih baik untuk menyebar antara hos dan bertahan dalam persekitaran yang keras, dengan kolonis yang lebih kuat, penghasilan spora yang lebih tinggi, dan sedikit peningkatan motiliti.12
Walaupun ST81 menunjukkan potensi tinggi untuk penyebaran, rintangan antibiotik yang tinggi dan prognosis yang buruk, kajian mengenai ciri epidemiologi strain ini masih terhad. Berbanding dengan ST lain, ciri molekul seperti kepelbagaian genetik, struktur populasi, evolusi genom, dan patogenisiti dalam C. difficile ST81 di China perlu diteliti. Oleh itu, kami telah melakukan WGS dan analisis filogenomik resolusi tinggi pada isolat ST81 di China dengan matlamat untuk: 1) mengenal pasti kepelbagaian genetik dan struktur populasi; 2) mengenal pasti mekanisme rintangan; dan 3) menganalisis hubungan filogenetik antara isolat ST81. Diharapkan data kami dapat menyediakan asas yang kukuh untuk penyelidikan mendalam di masa hadapan mengenai penghalang fungsi dalam C. difficile ST81 untuk memaklumkan strategi baru bagi meningkatkan pencegahan serta pengawalan jangkitan dan pengurusan pesakit.
Bahan dan Kaedah Pengumpulan Isolat C. difficile Antara Januari 2010 hingga Januari 2021, sampel najis telah dikumpul dari pesakit dewasa yang memerlukan pengesanan C. difficile di lima hospital terkemuka di pelbagai kawasan di China (HA, HB, HC, HD, HE). Sampel najis tersebut telah dijalankan kultur anaerobik di atas agar cycloserine-cefoxitin-taurocholate (CCFA-TA; Oxoid) yang ditambah 7% (v/v) serum kambing pada suhu 35°C selama 48 jam sebelum pengasingan. Koloni C. difficile yang dipercayai telah dikenalpasti menggunakan Brooke Matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF) (Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Germany).
Pengesanan Gen Toksin melalui Reaksi Rantaian Polimerase (PCR) Setelah 48 jam kultur agar darah anaerob, isolat C. difficile telah digantungkan dalam air suling di dalam tabung mikrocentrifuge. DNA genomik kemudiannya diekstrak menggunakan kaedah lisis alkali yang dipermudahkan. Semua strain yang terasing telah diuji untuk gen tcdA, tcdB, dan gen toksin binari melalui PCR, seperti yang telah diterangkan sebelum ini.13 Secara ringkas, pasangan primer yang digunakan adalah NK9/NK11 untuk tcdA, NK104/NK105 untuk tcdB, cdtApos/cdtArev untuk cdtA, dan cdtBpos/cdtBrev untuk cdtB. Pengukuhan PCR dengan pasangan primer NK9/NK11 dijalankan selama 35 kitaran, terdiri daripada 95°C selama 20s dan 62°C selama 120s. Profil termal untuk pasangan primer NK104/NK105 adalah 35 kitaran terdiri daripada 95°C selama 20s dan 55°C selama 120s. Reaksi untuk gen cdtA dan cdtB telah menjalani 30 kitaran pada 94°C selama 45s, 52°C selama 60s, dan 72°C selama 80s. Strain C. difficile ATCC BAA-1870 (ribotyping 027) digunakan sebagai kawalan template positif untuk gen toksin.
Penyekatan Urutan Multi-lokus (MLST) Untuk mengenal pasti kepelbagaian genetik dan menentukan ST isolat C. difficile, MLST daripada tujuh gen rumah tangga (adk, atpA, dxr, glyA, recA, soda, dan tpi) digunakan untuk menggenotip semua isolat toksigenik mengikut protokol yang sebelumnya diterangkan.14 Secara ringkas, syarat penguatan setiap gen rumah tangga adalah 95°C selama 15 min, diikuti oleh 35 kitaran di 94°C selama 30s, 50°C selama 40s, dan 72°C selama 70s. Penetapan alel diperoleh melalui halaman pertanyaan profil batch C. difficile PubMLST untuk menentukan ST, seperti yang diterangkan sebelum ini.8
Penjujukan Genom dan Pembinaan DNA genomik berkualiti tinggi bagi semua strain C. difficile yang dikenalpasti sebagai ST81 telah diekstrak menggunakan kit DNeasy Blood and Tissue (Qiagen, Hilden, Germany) mengikut arahan pengeluar, dan dikira menggunakan sistem Qubit 2.0. WGS telah dilaksanakan menggunakan instrumen Illumina NovaSeq 6000 (Illumina, San Diego, CA, USA), mencapai liputan penjujukan sebanyak 200X. Sebelum pembinaan, kawalan kualiti bacaan yang dijadualkan dijalankan menggunakan FastQC dan kawasan pemotongan ditrim menggunakan Trimmomatic.15 Bacaan yang telah ditrim diassemble secara de novo menggunakan SPAdes.16 Jumlah saiz pembinaan genom adalah kira-kira 4.2 Mb, dengan panjang scaffold N50 kira-kira 0.5Mb dan kandungan GC sebanyak kira-kira 28.93%. Genom telah dianotasi menggunakan Prokka.17
Analisis Filogenetik dan Evolusi Untuk menyelidik struktur populasi, pohon maksimum kemungkinan dibina berdasarkan penyelarasan genoma teras yang diperoleh dalam Roary menggunakan MEGA 11 dengan 1000 replikasi bootstrap dan divisualisasikan menggunakan perkhidmatan web Interactive Tree of Life.18,19 Selanjutnya, untuk meneliti kejadian penyebaran C. difficile ST81, polymorfisme nukleotida tunggal (SNP) telah dipanggil menggunakan Snippy (http://github.com/tseemann/snippy) dengan parameter lalai. Genom C. difficile M68 (NC_017175.1) berfungsi sebagai rujukan. Fail penyelarasan ditapis daripada variasi dengan kepadatan tinggi penggantian asas sebagai kawasan yang berpotensi berulang, elemen genetik mudah alih (MGEs), dan kejadian rekombinasi oleh Gubbins dan digunakan untuk mengira SNP secara berpasangan oleh SNP-dists (https://github.com/tseemann/snp-dists).20 Minimum spanning trees dibina di PHYLOViZ berdasarkan jadual SNP berpasangan yang dihasilkan.21
Untuk meneroka evolusi C. difficile ST81, analisis evolusi Bayesian dilakukan menggunakan BEAST, yang menggunakan tiga model jam, dua model populasi, dan dua model lokasi, seperti yang diterangkan sebelumnya oleh Xu et al.22
Pengesanan Gen Rintangan Antimikrob (AMR), Gen Virulensi, dan Transposon Untuk menyelidik ciri genetik C. difficile ST81, gen AMR telah dikesan berdasarkan Comprehensive Antibiotic Resistance Database (CARD) (https://card.mcmaster.ca). Tambahan pula, gen virulensi dikenalpasti berdasarkan databasa Faktor Virulensi Tempatan (VFDB) (https://www.mgc.ac.cn/VFs/). Untuk analisis mutasi, urutan gyrA dan gyrB telah diekstrak dan dibandingkan dengan urutan rujukan yang dimuat turun dari CARD menggunakan Alat Pencarian Penjajaran Tempatan Asas (BLAST). Unsur transposable telah dikesan menggunakan Vrprofile2.23
Analisis Pangenome-Luas Melalui Kajian Kumpulan (Pan-GWAS) dan Kumpulan Gen Orthologous (COG) Analisis Analisis Bayesian mengenal pasti dua sub-garis C. difficile ST81 yang berbeza, iaitu sub-garis I (SL I) dan SL II. Untuk menentukan lokasi genetik yang signifikan yang dikaitkan dengan setiap sub-garis, pan-GWAS semua genom C. difficile ST81 dijalankan. Secara ringkas, semua anotasi genom C. difficile ST81 dilakukan dengan Prokka.17 Roary digunakan untuk menganggar saiz teras dan genom aksesori, dan hasilnya digunakan sebagai input untuk Scoary untuk mengenal pasti lokasi genetik yang penting yang dikaitkan dengan setiap sub-garis.19,24 Selain itu, gen diekstrak dari semua genom menggunakan skrip Python buatan sendiri dan dimuat naik ke eggNOG-mapper (http://eggnog-mapper.embl.de/) untuk meneroka fungsi gen.
Analisis Data Analisis statistik dijalankan menggunakan SPSS versi 23.0 (SPSS, Chicago, IL, USA).
Keputusan Analisis Epidemiologi dan Karakterisasi Isolat C. difficile Jumlah 871 (9.0%) isolat C. difficile toksigenik tidak duplikat telah dikenalpasti dari 9675 pesakit yang mengalami cirit-birit sepanjang tempoh kajian. Dalam kalangan isolat ini, sejumlah 59 ST telah dikenalpasti (data tidak ditunjukkan), dengan ST81 menyumbang 12.4% (108/871). Kebanyakan strain ST81 diasingkan daripada pesakit dalam (94.4%, 102/108) manakala 5.6% (6/108) dari pesakit luar. Sepanjang tempoh ini, strain C. difficile ST81 telah diasingkan setiap tahun dari lima hospital yang terlibat, tetapi pengedaran strain C. difficile berbeza-beza di antara hospital dari masa ke masa (Rajah 1).
Rajah 1 Pengedaran 108 isolat di hospital dan tahun yang berbeza.

Analisis Filogenetik dan Ciri Genomik C. difficile ST81 Data WGS bagi 108 isolat telah dianalisis setelah kawalan kualiti urutan dan pemetaan kepada C. difficile M68 (NC_017175.1). Sebanyak 11,950 gen diramalkan mengandungi pangenome C. difficile ST81. Gen teras (iaitu, gen yang hadir dalam lebih 99% genom) yang biasanya digunakan untuk menilai kepelbagaian genom dalam spesies, mewakili 29.9% (3568/11,950) daripada pangenome, sementara gen awan, gen cengkerang, dan gen teras lembut masing-masing menyumbang 63.8% (7630/11,950), 5.8% (695/11,950), dan 0.5% (57/11,950).
Tujuh gen AMR dikesan di mana ermB dan tetM dikesan dalam semua tetapi satu strain (s15013004 dan s13071105, masing-masing) (Rajah 2A). Gen clbA, dfrF, dan cfrB dikesan dalam sejumlah kecil strain. Selain itu, majoriti isolat ST81/RT369 C. difficile didapati mempunyai mutasi gyrA (91.7%, 99/108), yang menunjukkan sebagai mutasi asid amino Thr82Ile yang memberikan rintangan terhadap fluoroquinolone.
Rajah 2 Analisis filogenetik 108 strain C. difficile ST81 berdasarkan polymorfisme nukleotida tunggal (SNP) dalam genom teras. (A) Pohon filogenetik dibina, menggambarkan hubungan antara strain serta menyenaraikan nombor strain, rintangan antimikrob, transposon, dan gen virulensi di setiap hospital. (B) Minimum spanning tree C. difficile ST81 menunjukkan pembentukan kluster transmisi klon berdasarkan polymorfisme nukleotida tunggal genom teras.

Sebagai unsur genetik mudah alih yang penting, elemen integratif dan konjugatif bertanggungjawab untuk pemindahan gen secara mendatar, yang memacu peningkatan kepelbagaian genetik serta pengambilan gen luar.25 Dalam 108 isolat ini, hanya dua jenis transposon, Tn916, dan Tn6189, telah dikenalpasti. Kecuali satu, kami telah mengesan Tn916 dalam kebanyakan isolat C. difficile ST81/RT369 sementara 89.8% (97/107) isolat mengandungi Tn6189. Tn916, yang mengodkan rintangan terhadap tetracycline dan minocycline melalui Tet (M), merupakan keluarga besar transposon yang dilaporkan dalam C. difficile, sementara Tn6189, yang dijelaskan buat kali pertama pada 2019, merupakan pembawa gen ermB.26,27
Untuk membangunkan filogeografi mendalam C. difficile ST81 di China, panggilan cgSNP dilakukan. Penjajaran cgSNP terdiri daripada 1,589,277 bp. Jarak cgSNP secara berpasangan antara strain adalah purata 13 cgSNPs (jalur, 0–425 cgSNPs). Untuk resolusi yang lebih baik bagi filogenetik C. difficile ST81, kami membina pohon filogenetik maksimum kemungkinan dan minimum spanning tree berdasarkan cgSNP ini (Rajah 2B). Kedua-dua kaedah menunjukkan adanya strain yang sangat serupa di kawasan yang sangat berbeza di China.
Evolusi Molekul dan Penyebaran C. difficile ST81/RT369 di China Untuk menerokai pola evolusi C. difficile ST81, semua genom dengan butiran tarikh pengumpulan digunakan untuk membina pohon filogenetik Bayesian. Berdasarkan topologi pohon, pohon evolusi Bayesian menunjukkan kehadiran dua sub-garis yang genetik berbeza, dinamakan SL I dan SL II (Rajah 3A), dan menganggarkan bahawa SL I muncul dengan nenek moyang yang paling baru ^c.2009 sementara SL II muncul ^c.2010 (anggaran median dengan selang posterior tertinggi 95% adalah 2003 hingga 2009 bagi semua strain C. difficile ST81). Tambahan pula, pohon evolusi Bayesian juga menunjukkan bahawa kedua-dua sub-garis muncul secara bebas. Pengedaran strain dalam SL I tidak bergantung kepada hospital atau waktu, manakala strain dalam SL II kebanyakannya diasingkan dari Hospital A. Menariknya, semua strain dari SL II membawa gen rintangan ermB dan tetM, mutasi gyrA, dan Tn916 sementara gen rintangan clbA, dfrF, dan cfrB hanya dikesan dalam SL I.
Rajah 3 Evolusi 108 genom C. difficile ST81 sepanjang waktu. (A) Pohon filogenetik Bayesian dibina, menggambarkan nombor strain, rintangan antimikrob, transposon, dan gen virulensi di setiap hospital. Dua sub-garis utama didefinisikan: SL I dan SL II. (B) Plot Manhattan bagi pengasosiasian gen dalam dua sub-garis berdasarkan analisis asosiasi genome-wide. Pengasosiasian gen dengan fenotip ditentukan menggunakan ujian Kruskal-Wallis berganda. (C) Pengedaran proteina yang diekspresikan secara berbeza di antara dua sub-garis C. difficile ST81 mengikut kategori fungsional COG.

Analisis Pangenome Untuk menilai perbezaan antara dua sub-garis C. difficile ST81 yang dikenalpasti melalui analisis Bayesian, kami telah melakukan analisis pangenome bagi isolat ini. Perbandingan antara dua sub-garis C. difficile ST81 yang berbeza menyebabkan pengenalpastian 2 dan 15 gen unik dalam isolat SL I dan SL II, masing-masing (Rajah 3B). Untuk memahami fungsi gen unik ini dalam isolat C. difficile ST81, gen unik yang signifikan dalam kedua-dua sub-garis telah ditetapkan kepada kategori fungsional COG. Gen unik dalam SL II lebih banyak terkumpul dalam pelbagai kategori COG berbanding dengan SL I (Rajah 3C dan Jadual 1). Proportion terbesar gen unik tergolong dalam fungsi yang tidak dikenali, diikuti oleh transkripsi dan mekanisme pertahanan. Penting untuk dicatat bahawa mekanisme transduksi isyarat, biogenesis dinding sel/membran/envelope, replikasi, rekombinasi, dan pembaikan, serta pengangkutan karbohidrat dan gen metabolisme dalam isolat SL II jauh lebih banyak berbanding dalam isolat SL I, yang mungkin memberikan kemampuan kepada isolat ini untuk mempertahankan diri dari rangsangan negatif, membolehkan mereka menggunakan tenaga lebih untuk menyesuaikan diri dengan persekitaran.
Jadual 1 Penjelasan Fungsi Gen Yang Diekspresikan Berbeza Antara SL I ke SL II

Perbincangan Dilaporkan bahawa prevalensi CDI di daratan China adalah 14%, sementara ST81 merupakan salah satu ST yang umum.28,29 Dalam survei longitudinal dan sistematik terhadap CDI di China ini, kajian multi-pusat telah dilakukan di lima hospital terkemuka bagi memahami lebih lanjut tentang epidemiologi molekul C. difficile ST81. Hasil kajian menunjukkan bahawa ST81 menyumbang 12.4% daripada semua isolat toksigenik C. difficile. Analisis pohon filogenetik menunjukkan adanya strain yang sangat mirip di kawasan yang berbeza di China. Dua sub-garis utama C. difficile ST81 telah dikenalpasti berdasarkan perbezaan dalam struktur gen.
Beberapa kajian di C. difficile menunjukkan bahawa klon A-B+ ST37/RT17, yang negatif TcdA dan positif TcdB, adalah yang paling umum di Asia.5 Walau bagaimanapun, kajian lain juga mengesan genotip A-B+ ST81 sebagai klon utama dan penyebab wabak di China sejak ia dikenalpasti pada 2010.30 Dalam kajian ini, walaupun ST81 bukan yang paling umum, ia menyumbang 12.4% daripada isolat yang dianalisis, serupa dengan data daripada kajian pengawasan multi-pusat di Jepun antara April 2012 dan Mac 2013.7 Namun, beberapa kajian di China baru-baru ini menunjukkan bahawa ST81 adalah genotip utama yang bertanggungjawab terhadap wabak C. difficile.6,9 Walaupun punca sebenarnya kurang jelas, beberapa kajian mencadangkan bahawa ini mungkin disebabkan oleh peningkatan kadar rintangan serta penghasilan spora yang lebih tinggi dan tahan terhadap rawatan dalam genotip ini.9,31 Namun, komposisi strain C. difficile ST81 berbeza-beza di hospital yang dikaji.6 Trend yang serupa dilihat dalam kajian ini, menunjukkan perlunya mewujudkan rangkaian pengawasan sebagai strategi penting untuk pemantauan epidemiologi C. difficile, serta untuk mengawal penularan CDI.
Rintangan antibiotik memainkan peranan penting dalam patogenesis dan penyebaran CDI, kerana ia membolehkan C. difficile bertahan daripada pendedahan antimikrob di dalam hos, sementara tekanan selektif membenarkan muncul dan penyebaran strain AMR.32 Khususnya, rintangan fluoroquinolone yang diakibatkan oleh mutasi gyrA (Thr82Ile) dalam C. difficile RT027/ST1 dianggap telah memfasilitasi pengembangan dan penyebaran cepat di Amerika Utara dan Eropah pada awal 2000-an.33 Isolat C. difficile ST81 telah menunjukkan kadar rintangan vitro tertinggi untuk banyak kelas antimikrob, seperti fluoroquinolones (ciprofloxacin, levofloxacin, dan moxifloxacin), tetracyclines, dan macrolide-lincosamide-streptogramin B (MLSB).6 Walaupun ujian kepekaan antimikrob tidak dijalankan untuk isolat ST81 dalam kajian ini, penyelidikan sebelum ini telah证实kan hubungan yang baik antara fenotip dan genotip rintangan.34 Dalam kajian ini, kami mendapati bahawa kebanyakan isolat membawa gen rintangan (tetM, ermB) dan mutasi dalam gyrA dikesan dalam hampir semua strain. Menariknya, gen cdeA yang dikenali sebagai transporter efflux multidrug yang tergolong dalam keluarga multidrug dan toxic compound extrusion (MATE-family), telah ditunjukkan memberikan rintangan bukan sahaja kepada etidium bromida dan acriflavin tetapi juga kepada antibiotik, khususnya fluoroquinolone dan, dalam beberapa kes, aminoglikosida. Dengan jelas, gen ini hadir dalam semua isolat.35 Namun, dalam kajian lain, gen ini ditemui dalam strain yang rintangan dan yang tidak rintangan terhadap levofloxacin.36 Penyelidikan lebih lanjut tentang peranan gen cdeA diperlukan untuk memahami mekanisme di sebaliknya. Menariknya, sementara rintangan rifamycin adalah ciri khas bagi C. difficile ST37/RT17, tiada gen rintangan rifamycin yang dikenal pasti dalam isolat yang dianalisis dalam kajian ini.13 Fenomena ini menunjukkan kemungkinan bahawa meskipun C. difficile ST81 dan C. difficile ST37/RT17 adalah genotip utama dalam klad 4, tetapi kedua-duanya mungkin mempunyai ciri molekul yang berbeza.12 Nota menarik lain adalah bahawa Tn916 dan Tn6189 ditemui dalam kebanyakan isolat C. difficile ST81. Kedua-dua transposon ini mengandungi gen rintangan (tetM dan ermB, masing-masing), yang mungkin membantu menerangkan mengapa C. difficile ST81 mempunyai gen rintangan yang disebutkan di atas. Ini juga menunjukkan potensi peranan transposon dalam pemindahan gen rintangan secara mendatar.
Pelbagai sumber melaporkan bahawa C. difficile ST81 menyebabkan penyebaran nosokomial di sebuah hospital umum di China.10 Kajian ini mengikuti pendekatan yang ditentukan oleh Eyre et al., yang mana ambang 0–2 cgSNP digunakan untuk menentukan sama ada kumpulan dua atau lebih strain adalah berkait genetik.37 Pohon filogenetik yang dibina berdasarkan cgSNP memberikan interpretasi yang jelas mengenai hubungan evolusi antara semua isolat C. difficile ST81 dalam kajian ini, yang menunjukkan bahawa strain dalam klad yang sama lebih berkait rapat antara satu sama lain dan mungkin mempunyai nenek moyang evolusi yang sama. Oleh kerana isolat dikumpul sepanjang waktu di pelbagai lokasi di China, dan tiada persilangan waktu dan ruang ditemui setelah memeriksa maklumat klinikal, kami tidak dapat menyimpulkan bahawa genotip ini menyebabkan penyebaran temporal-spatial di China. Namun, kami berpendapat bahawa genotip ini mengalami evolusi yang lebih perlahan sementara C. difficile ST81 menunjukkan perbezaan cgSNP intra-ST yang rendah dengan nilai purata 13 cgSNPs. Kami juga tidak dapat conclude bahawa mereka mungkin mempunyai hubungan dengan wabak semasa atau terdedah kepada sumber umum. Data ini menunjukkan bahawa isolat C. difficile ST81 secara genetik lebih rapat berkait satu sama lain berbanding dengan garis ST lain, dan isolat yang berkait dapat dikenalpasti tanpa mengira asal geografi. Analisis pangenome menunjukkan pangenome terbuka, dengan genom aksesori menyumbang 70.1%. Berbanding dengan garis lain seperti RT014 dan ST11, pangenome aksesori mereka masing-masing adalah 69.7% dan 80.2%, yang serupa dengan ST81.38,39 Penemuan ini memerlukan penyelidikan lanjut untuk memahami sebab-sebab evolusi dan implikasi epidemiologi bagi ST dengan pangenome terbuka. Tingkat kepelbagaian yang rendah ditemui dalam kajian ini menunjukkan bahawa ST81 adalah klon yang tahan dan berada di pelbagai kawasan. Kajian oleh Thiel et al. menunjukkan bahawa bakteria dari baja boleh melarikan diri ke atmosfera semasa penggemburan tanah pertanian dan dibawa ribuan kilometer jauh.40,41 Walau bagaimanapun, sebab sebenar bagi penyebaran jarak jauh atau genom teras berkonservasi C. difficile ST81 masih belum jelas dan memerlukan penyelidikan lebih lanjut.
Analisis evolusi Bayesian menunjukkan bahawa C. difficile ST81 yang diasingkan dari kajian ini membentuk dua sub-garis yang berasingan dan dapat dipindahkan secara stabil berdasarkan perbezaan dalam strukturnya. Walaupun tidak secara eksklusif mengandungi strain dari satu kawasan, penyebaran C. difficile ST81 bermula pada tahun 2008, yang berasal dari nenek moyang yang sama. Dari analisis ini, kami menganggarkan bahawa penyebaran C. difficile ST81 mungkin bermula dengan pergerakan populasi di Hospital A sebelum merebak ke hospital lain di kawasan yang berbeza. Walaupun mekanismenya tidak jelas, mengingat bahawa genotip C. difficile ST81 pertama kali ditemui di Jepun, kami berhipotesis bahawa Hospital A terletak di bandar besar dengan pertukaran yang kerap melibatkan orang Jepun dan pelancong antarabangsa, interaksi ini mungkin memudahkan penyebaran.7 Tambahan lagi, terdapat perbezaan signifikan dalam ciri genetik di dua sub-garis. Menggunakan analisis GWAS, kami mendapati bahawa isolat SL II yang mengandungi lebih banyak gen unik adalah berkaitan dengan mekanisme transduksi isyarat dan biogenesis dinding sel/membran/envelope, yang mungkin membolehkan isolat ini mempertahankan diri lebih baik terhadap rangsangan negatif dan menggunakan tenaga lebih untuk menyesuaikan diri dengan persekitaran. Ini selanjutnya menunjukkan bahawa strain SL II dilokalisasi hanya di dua kawasan.
Penting untuk mengakui beberapa kekurangan dalam studi ini. Meskipun kami mengumpul isolat dari pesakit dengan cirit-birit di lima hospital terkemuka di seluruh daratan China, kawasan tertentu perlu diselidiki lebih lanjut, seperti memperluas pengawasan ke lebih banyak hospital dan menyelidiki takungan persekitaran. Kedua, kami tidak melakukan ujian kepekaan antimikrob secara in vitro bagi isolat C. difficile ST81 ini, yang bermaksud bahawa kekurangan ujian kepekaan antimikrob membataskan kemampuan untuk menghubungkan penanda rintangan genetik dengan fenotip rintangan yang sebenarnya. Ketiga, C. difficile ST81 kini bukan genotip yang umum di luar China, dan tiada data WGS global yang mencukupi. Selain itu, lebih banyak kajian fungsional mendalam mengenai gen unik yang terdapat dalam strain SL II diperlukan. Oleh itu, representasi dalam kajian ini memerlukan penelitian lebih lanjut dengan melibatkan lebih banyak isolat.
Kesimpulan Dalam kajian ini, kami menyelidik kepelbagaian genetik 108 isolat C. difficile ST81 dengan variasi temporal dan geografi. Data kami menunjukkan bahawa C. difficile ST81 mempunyai kadar rintangan yang tinggi terhadap pelbagai antibiotik dan sedang beredar di daratan China. Analisis filogeografi dari cgSNP yang dipetik melalui WGS menunjukkan adanya dua sub-garis utama (SL I dan SL II), yang mempunyai nenek moyang bersama, walaupun SL II menunjukkan keupayaan penyesuaian yang lebih baik terhadap persekitaran dengan gen-gen relatif. Dengan mempertimbangkan rintangan antibiotik yang luar biasa dan pengawalan dalam gen-gen teras C. difficile ST81, pengawasan terhadap genotip ini perlu diperkukuhkan lagi untuk meningkatkan pengawalan penyakit dan mengurangkan risiko wabak di masa hadapan.
Pernyataan Perkongsian Data Urutan genetik isolat C. difficile ST81 dalam kajian ini telah disimpan di GenBank dengan nombor akses PRJNA432876. Data kajian ini boleh diperoleh dengan menghubungi pengarang yang bertanggungjawab dengan permintaan yang wajar.
Kelulusan Etika Untuk kajian pemerhatian ini, keperluan untuk persetujuan pesakit tidak diperlukan. Data tidak dapat dikenali kembali kepada pesakit yang asalnya; persetujuan etika telah diabaikan.
Pembiayaan Kajian ini disokong oleh Program Penyelidikan Awam Asas Wilayah Zhejiang (No. LGF20H030004), dan Yayasan Sains Semulajadi Nasional China (No. 82073609).
Pengisytiharan Penulis melaporkan tiada konflik kepentingan dalam kerja ini.
Rujukan 1. Sandhu BK, McBride SM. Clostridioides difficile. Trends Microbiol. 2018;26(12):1049–1050. doi:10.1016/j.tim.2018.09.004
2. Guh AY, Kutty PK. Clostridioides difficile Infection. Ann Intern Med. 2018;169(7):ITC49–ITC64. doi:10.7326/AITC201810020
3. Rupnik M. Heterogeneity of large clostridial toxins: importance of Clostridium difficile toxinotypes. FEMS Microbiol Rev. 2008;32(3):541–555. doi:10.1111/j.1574-6976.2008.00110.x
4. Stabler RA, He M, Dawson L, et al. Comparative genome and phenotypic analysis of Clostridium difficile 027 strains provides insight into the evolution of a hypervirulent bacterium. Genome Biol. 2009;10(9):R102. doi:10.1186/gb-2009-10-9-r102
5. Imwattana K, Knight DR, Kullin B, et al. Clostridium difficile ribotype 017 – characterization, evolution and epidemiology of the dominant strain in Asia. Emerg Microbes Infect. 2019;8(1):796–807. doi:10.1080/22221751.2019.1621670
6. Cheng JW, Liu C, Kudinha T, et al. The tcdA-negative and tcdB-positive Clostridium difficile ST81 clone exhibits a high level of resistance to fluoroquinolones: a multi-centre study in Beijing, China. Int J Antimicrob Agents. 2020;56(1):105981. doi:10.1016/j.ijantimicag.2020.105981
7. Senoh M, Kato H, Fukuda T, et al. Predominance of PCR-ribotypes, 018 (smz) and 369 (trf) of Clostridium difficile in Japan: a potential relationship with other global circulating strains? J Med Microbiol. 2015;64(10):1226–1236. doi:10.1099/jmm.0.000149
8. Chen YB, Gu SL, Wei ZQ, et al. Molecular epidemiology of Clostridium difficile in a tertiary hospital of China. J Med Microbiol. 2014;63(Pt 4):562–569. doi:10.1099/jmm.0.068668-0
9. Yang Z, Huang Q, Qin J, et al. Molecular epidemiology and risk factors of clostridium difficile ST81 infection in a teaching hospital in Eastern China. Front Cell Infect Microbiol. 2020;10:578098. doi:10.3389/fcimb.2020.578098
10. Qin J, Dai Y, Ma X, et al. Nosocomial transmission of Clostridium difficile genotype ST81 in a general teaching hospital in China traced by whole genome sequencing. Sci Rep. 2017;7(1):9627. doi:10.1038/s41598-017-09878-8
11. Liu Y, Ma L, Cheng J, Su J. Effects of omeprazole on recurrent clostridioides difficile infection caused by ST81 strains and their potential mechanisms. Antimicrob Agents Chemother. 2023;67(6):e0022123. doi:10.1128/aac.00221-23
12. Su T, Chen W, Wang D, et al. Complete genome sequencing and comparative phenotypic analysis reveal the discrepancy between Clostridioides difficile ST81 and ST37 Isolates. Front Microbiol. 2021;12:776892. doi:10.3389/fmicb.2021.776892
13. Chen YB, Gu SL, Shen P, et al. Molecular epidemiology and antimicrobial susceptibility of Clostridium difficile isolated from hospitals during a 4-year period in China. J Med Microbiol. 2018;67(1):52–59. doi:10.1099/jmm.0.000646
14. Griffiths D, Fawley W, Kachrimanidou M, et al. Multilocus sequence typing of Clostridium difficile. J Clin Microbiol. 2010;48(3):770–778. doi:10.1128/JCM.01796-09
15. Bolger AM, Lohse M, Usadel B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 2014;30(15):2114–2120. doi:10.1093/bioinformatics/btu170
16. Bankevich A, Nurk S, Antipov D, et al. SPAdes: a new genome assembly algorithm and its applications to single-cell sequencing. J Comput Biol. 2012;19(5):455–477. doi:10.1089/cmb.2012.0021
17. Seemann T. Prokka: rapid prokaryotic genome annotation. Bioinformatics. 2014;30(14):2068–2069. doi:10.1093/bioinformatics/btu153
18. Tamura K, Stecher G, Kumar S. MEGA11: molecular evolutionary genetics analysis version 11. Mol Biol Evol. 2021;38(7):3022–3027. doi:10.1093/molbev/msab120
19. Page AJ, Cummins CA, Hunt M, et al. Roary: rapid large-scale prokaryote pan genome analysis. Bioinformatics. 2015;31(22):3691–3693. doi:10.1093/bioinformatics/btv421
20. Croucher NJ, Page AJ, Connor TR, et al. Rapid phylogenetic analysis of large samples of recombinant bacterial whole genome sequences using Gubbins. Nucleic Acids Res. 2015;43(3):e15. doi:10.1093/nar/gku1196
21. Francisco AP, Vaz C, Monteiro PT, Melo-Cristino J, Ramirez M, Carrico JA. PHYLOViZ: phylogenetic inference and data visualization for sequence based typing methods. BMC Bioinf. 2012;13:87. doi:10.1186/1471-2105-13-87
22. Xu X, Luo Y, Chen H, et al. Genomic evolution and virulence association of Clostridioides difficile sequence type 37 (ribotype 017) in China. Emerg Microbes Infect. 2021;10(1):1331–1345. doi:10.1080/22221751.2021.1943538
23. Wang M, Goh YX, Tai C, Wang H, Deng Z, Ou HY. VRprofile2: detection of antibiotic resistance-associated mobilome in bacterial pathogens. Nucleic Acids Res. 2022;50(W1):W768–W773. doi:10.1093/nar/gkac321
24. Brynildsrud O, Bohlin J, Scheffer L, Eldholm V. Rapid scoring of genes in microbial pan-genome-wide association studies with scoary. Genome Biol. 2016;17(1):238. doi:10.1186/s13059-016-1108-8
25. He M, Sebaihia M, Lawley TD, et al. Evolutionary dynamics of Clostridium difficile over short and long time scales. Proc Natl Acad Sci U S A. 2010;107(16):7527–7532. doi:10.1073/pnas.0914322107
26. Jon JV, Mark HW, Jane F. Antimicrobial resistance progression in the United Kingdom: a temporal comparison of Clostridioides difficile antimicrobial susceptibilities. Anaerobe. 2021;70:102385. doi:10.1016/j.anaerobe.2021.102385
27. Imwattana K, Kiratisin P, Riley TV, Knight DR. Genomic basis of antimicrobial resistance in non-toxigenic Clostridium difficile in Southeast Asia. Anaerobe. 2020;66:102290. doi:10.1016/j.anaerobe.2020.102290
28. Tang C, Cui L, Xu Y, et al. The incidence and drug resistance of Clostridium difficile infection in Mainland China: a systematic review and meta-analysis. Sci Rep. 2016;6(1):37865. doi:10.1038/srep37865
29. Wen BJ, Dong N, Ouyang ZR, et al. Prevalence and molecular characterization of Clostridioides difficile infection in China over the past 5 years: a systematic review and meta-analysis. Int J Infect Dis. 2023;130:86–93. doi:10.1016/j.ijid.2023.03.009
30. Byun JH, Kim H, Kim JL, et al. A nationwide study of molecular epidemiology and antimicrobial susceptibility of Clostridioides difficile in South Korea. Anaerobe. 2019;60:102106. doi:10.1016/j.anaerobe.2019.102106
31. Wang B, Peng W, Zhang P, Su J. The characteristics of Clostridium difficile ST81, a new PCR ribotype of toxin A- B+ strain with high-level fluoroquinolones resistance and higher sporulation ability than ST37/PCR ribotype 017. FEMS Microbiol Lett. 2018;365(17). doi:10.1093/femsle/fny168
32. Imwattana K, Knight DR, Kullin B, et al. Antimicrobial resistance in Clostridium difficile ribotype 017. Expert Rev Anti Infect Ther. 2020;18(1):17–25. doi:10.1080/14787210.2020.1701436
33. He M, Miyajima F, Roberts P, et al. Emergence and global spread of epidemic healthcare-associated Clostridium difficile. Nat Genet. 2013;45(1):109–113. doi:10.1038/ng.2478
34. Imwattana K, Putsathit P, Knight DR, Kiratisin P, Riley TV. Molecular characterization of, and antimicrobial resistance in, clostridioides difficile from Thailand, 2017-2018. Microb Drug Resist. 2021;27(11):1505–1512. doi:10.1089/mdr.2020.0603
35. Dridi L, Tankovic J, Petit JC. CdeA of Clostridium difficile, a new multidrug efflux transporter of the MATE family. Microb Drug Resist. 2004;10(3):191–196. doi:10.1089/mdr.2004.10.191
36. Li X, Wang Y, Cao R, et al. Antimicrobial resistance of clostridioides difficile in children from a tertiary pediatric hospital in Shanghai, China. Infect Drug Resist. 2024;17:329–339. doi:10.2147/IDR.S441312
37. Eyre DW, Cule ML, Wilson DJ, et al. Diverse sources of C. difficile infection identified on whole-genome sequencing. N Engl J Med. 2013;369(13):1195–1205. doi:10.1056/NEJMoa1216064
38. Knight DR, Squire MM, Collins DA, Riley TV. Genome analysis of Clostridium difficile PCR ribotype 014 lineage in Australian pigs and humans reveals a diverse genetic repertoire and signatures of long-range interspecies transmission. Front Microbiol. 2016;7:2138. doi:10.3389/fmicb.2016.02138
39. Knight DR, Kullin B, Androga GO, et al. Evolutionary and genomic insights into clostridioides difficile sequence type 11: a diverse zoonotic and antimicrobial-resistant lineage of global one health importance. mBio. 2019;10(2). doi:10.1128/mBio.00446-19
40. Thiel N, Munch S, Behrens W, et al. Airborne bacterial emission fluxes from manure-fertilized agricultural soil. Microb Biotechnol. 2020;13(5):1631–1647. doi:10.1111/1751-7915.13632
41. O’Grady K, Hong S, Putsathit P, et al. Defining the phylogenetics and resistome of the major Clostridioides difficile ribotypes circulating in Australia. Microb Genom. 2024;10(5). doi:10.1099/mgen.0.001232


Source link
The post Epidemiologi Genomik C. difficile ST81/RT369 di Malaysia appeared first on Edisi Viral Plus.

---